2018年6月15日 星期五

Science:監測腸胃道健康狀況的可食性細菌電子系統

文獻標題

An ingestible bacterial-electronic system to monitor gastrointestinal health


基本資料

  • 作者:Mark Mimee
  • 年份:2018
  • 期刊:Science


關鍵字

  • edible electronics
  • Whole-cell bacterial biosensors


提要


體內複雜環境和訊息回傳方式限制了腸胃道分子的即時監控。此論文設計的微生物電子裝置(ingestible micro-bio-eletronic device, IMBED)結合具生物偵測功能的基改細菌,以及能將訊號傳輸到外部的電子元件。當體內分子經半透膜進入IMBED,基改細菌會將之代謝產生螢光,再為感光裝置接收,最後轉變成訊號傳遞至外部接收裝置。

為了檢驗此概念,作者首先設計了監測heme(出血標記分子)的基因迴路(genetic circuit),再轉殖到 E. coli MG1655並浸潤於不同種類、濃度的溶液中,測試其偵測heme的效力。進而以不同方式提升靈敏度後才轉殖到後續實驗用的 E. coli Nissle 1917。

在小鼠的實驗中確認此生物感測器能在腸道發揮作用後,作者進一步在豬隻身上測試IMBED的原型,結果顯示此裝置不僅電力、耐用、安全堪用,也能在兩小時內成功測得預先灌食的微量血液。此外,能監測其他生物分子的菌叢也證明效果正面,表示往後可以IMBED為平台,搭載多元的生物感應器監測體內環境,這將有助於診斷與治療腸胃道疾病。
測試IMBED成效的實驗手續


筆記


微生物作為生物感測器


優點
  • 微生物能感應外在變化。
  • 微生物能在體內環境生存。
  • 合成生物學技術足以改變微生物基因迴路(genetic circuits),監測特定分子。
  • 非侵入式檢查。
缺點
  • 分析對象為微生物在排遺中的基因表現,得操作繁瑣的分子生物試驗。
  • 由於無法即時得知監測結果,難以偵測半衰期短的分子。


微電子元件作為生物感測器


優點

  • 可安裝無線通訊系統。
  • 現今工程技術可以壓縮體積和能源需求。
  • 除了特定化學物質,也可監測光學、溫度和酸鹼值(導電量)
缺點

  • 腸胃道大小限制了感測器的體積,體積又限制能源和功能。


可食性微生物電子裝置(IMBED)

全名為ingestible micro-bio-eletronic device,由感測分子的生物系統和向外傳訊的電子系統組成,結合了微生物和電子元件的優點。
生物系統代謝目標分子後產生的螢光,被電子系統偵測並轉換為電子訊號傳輸到體外的接收裝置,例如手機或電腦等。


生物系統的基因迴路

作者以檢查腸胃出血為目標,設計了偵測heme的負調控基因迴路(genetic circuit)

  •  heme:血基質,紅血球破裂後會溢出的物質,可充作出血的標記。在此基因迴路中是inducer。
  • ChuA:可將heme運輸至細胞內的運輸蛋白。
  • PL(HrtO) :promoter 。
  • HrtR:repressor。
  • LuxCDABE:偵測到heme後需要表現的基因,例如螢光蛋白等。
當環境中有heme時,ChuA會將之運送到胞內,接著HrtR與之結合後不再抑制此基因組,於是LuxCDABE得以表現。


生物系統的 in vitro 測試


1. 評估基因迴路是否有效
  
將組成不同的基因迴路轉殖到E. coli MG1655,浸潤在不同的溶液中,以溶液濃度和螢光值為兩軸作圖。結果符合預期:僅帶有LuxCDABE的菌叢因不受任何物質抑制,有高螢光表現量;另一方面帶有抑制子HrtR,可是缺乏ChuA通道蛋白的菌叢,因為胞內缺乏heme所以不受溶液濃度影響,維持相對低的螢光表現量。惟同時帶有三種基因者,其螢光表現量能反應出溶液的濃度,故確認此基因迴路有效。

2. 提升基因迴路的靈敏度
雖然有很多途徑可能會改變HrtR和PL(HrtO) 的親和力,進而提升基因迴路的靈敏度,但是當中最有效的就屬改變HrtR基因的核醣體結合位(ribosome binding sites, RBS)。有較高轉錄起始能力(translational initiation strength)的結合位,HrtR基因表現量就會愈大,於是HrtR與PL(HrtO) 親和力更佳,在溶液濃度低時螢光表現量較低。

當溶液濃度升高,HrtR與PL(HrtO)親和力佳者的親和力改變幅度比親和力差者高,螢光表現量改變幅度也較大,所以顯得更靈敏。(斜體部分是我的推測。)
同樣是以E. coli MG1655為實驗材料。

3. 生物系統採用的菌種
將基因迴路轉殖到IMBED平台用的E. coli Nissle 1917 ,浸潤在不同的溶液中,分別以時間、濃度對螢光表現量作圖,結果顯示基改後的菌種能對裂解的血液快速反應,和先前的菌種相比有過之無不及。



生物系統的 in vivo測試


in vivo 以小鼠為材料,餵食Indomethacin誘發上消化道出血,再餵食血液感測器(即前述的基改細菌E. coli Nissle 1917),測試感測器效果。

1. 血液感測器通過腸胃道後的殘留比率。
在Indomethacin實驗前,先測試血液感測器通過腸胃道後的殘留比率,結果顯示在六小時後所有小鼠的排遺中皆殘有血液感測器,二十四小時後檢測不到血液感測器,換句話說它們沒有在腸胃道拓殖。

2. Indomethacin實驗
實驗設了兩個陰性對照:餵食Indomethacin/PBS buffer、在餵食Indomethacin前/後餵食血液感測器,腸胃出血會以guaiac test確認(一種糞便潛血測試)。結果顯示血液感測器確實能在活體中檢測到出血狀況。

3. 血液感測器殘留比率
Indomethacin實驗的排遺也同樣分析感測器殘留比率。(可是我看不出含意。)



電子系統的穩定度測試

每個IMBED的電子系統當中都有四條channel,其中一條reference channel負責校正背景光源以及因溫度產生的電流(而非因螢光產生電流),其餘三條則獨立量測後再平均得出觀測值。作者分別以輸入光功率、溫度和模擬胃液測試電子系統在不同情況下的穩定度,結果表示電子系統合用。

1. 輸入光功率( optical input power)
以各組IMBED內三條channel在不同功率下產出電流之平均值為x軸,各組的變異係數(coefficient of variation)為y軸。(由於我不懂意思所以只把圖放上來,原文中描述"The electronic system was highly sensitive and captured photon flux as low as 5 ×
104 photons/s incident on the 0.29-mm2 area
of the detectors "應該是不錯的意思。


2. 溫度變化
  
殘差分析(之前寫錯,待補)

3. 模擬胃液( Simulated Gastric Fluid
電子系統至少能在模擬胃液中穩定運作三十六小時,足以應付消化過程中生物分子的監測。


IMBED的in vitro測試

組合生物系統和電子系統為IMBED的原型,當中每個reference channel都裝配了Wild-type Nissle作對照。將IMBED浸潤於濃度不一的血液中,評估其感應時間。其中IMBED的感應比E. coli Nissle 1917延遲了一段時間,作者推論是分子從IMBED外擴散到內部的時間所致。
(y軸不同,這兩張圖只是參考用。)



IMBED的in situ測試
IMBED最後在三頭豬身上反覆測試。置放IMBED前,先餵食中和溶液避免裝置在酸性環境失效。

1. 測試IMBED在豬隻體內的反應時間
血液最早可以在餵食IMBED後52分鐘被偵測。其中僅餵食Buffer的控制組在一段時間後光電流微量提升的現象,作者歸因於飲食中少量的heme、安裝內視鏡時刮擦黏膜引發出血、或是從胃壁滲出的血液、……等腸胃道中的heme。另外光電流提升幅度在溫度變化造成的誤差範圍內(見電子系統的穩定度測試),或許是餵食低溫中和溶液影響了腸胃環境所致。

2. 評估IMBED最佳的反應時間


這是一張ROC曲線圖(receiver operating characteristic curve),用以分析偵測系統的優劣。以此實驗為例,判斷是否出血的依據是IMBED在腸胃道中測得的光電流量。如果我們訂定測得光電流量α代表診斷出腸胃道出血,那麼每次測得的結果就有四種:真陽性(診斷有,實際有)、假陽性(診斷有,實際無)、真陰性(診斷無,實際無)、假陰性(診斷無,實際有)。

曲線圖中y軸代表真陽性率(在所有實際為陽性的樣本中,被正確地判斷為陽性之比率。),x軸代表偽陽性率(在所有實際為陰性的樣本中,被錯誤地判斷為陽性之比率。),同一條曲線上的每個點都代表採用一種診斷標準時,樣本的真陽性率和偽陽性率,例如:圖中的紅點就代表「60分鐘後,光電流量高於α者代表腸胃道出血」的真陽性率約為0.8,偽陽性率約為0.5。

圖左上角的點(0,1)代表真陽性率為1,偽陽性率為0,代表這個診斷標準能完美的預測出血;反之,圖右下角的點(1,0)則是最差的預測。至於在圖中藍色線段上的點,它們的真陽性率和偽陽性率相同,代表這些診斷標準無異於隨機預測。

由於可以用不同診斷標準來判定是否出血,所以同是60分鐘後測得的光電流量的樣本就可以有好幾種比率,將之在圖上標記並連結起來就獲得ROC曲線。而ROC曲線底下面積(Area under the Curve of ROC , AUC ROC)的意涵是「若隨機抽取一個陽性樣本和一個陰性樣本,偵測器正確判斷陽性樣本的值高於陰性樣本之機率」,也就是說AUC愈大,則此偵測系統的正確率愈高。

此實驗中,經過120鐘後獲得的數據有最大的AUC值,因此是IMBED判斷最正確的反應時間。

3. 檢驗IMBED的信號是否源於帶有完整基因迴路的生物感測器

IMBED裝載帶有不同基因的E. coli Nissle 1917操作實驗。如圖所示,唯有帶完整感測基因的菌叢才能偵測螢光,表示此螢光是出血標記heme活化這些菌叢造成的,而不是豬隻腸胃道其他物質造成。(小鼠的實驗不做此測試是因為,IMBED原型最終要在豬體內測試,兩者腸胃道環境不同。)


展望和方向


  • 縮小IMBED,以便人類使用。
  • 搭載偵測不同分子的生物系統。
  • 在同一裝置內安裝更多channel,重複測試提降低誤差。
  • 改善菌叢保存方式。
  • 從一次性測試轉向留在體內長期監測。


疑問


  • 為什麼測試基因迴路和裝在IMBED平台上要用不同菌種?
  • 生物系統的 in vivo測試前,先計算血液感測器通過腸道殘留的比率之用意為何?
  • 裝置不能反映出血位置,只能用X光片或信號出現的時間反推。
  • 除非裝置能在測量途中歸零,不然無法判斷反覆出血,上消化道跟下消化道同時出血的話,裝置沒辦法區分。
  • 在IMBED的in vitro測試中,作者認為擴散速度影響了其反應時間。從IMBED的時間-光電流量曲線圖和E. coli Nissle 1917的時間-螢光值曲線圖的圖形,是否可以佐證這個看法?(雖然圖形跟座標和單位長設置有關)後者的圖形是典型的S狀,而前者卻接近線性,似乎為heme的擴散速率限制。另外,當濃度提升到250ppm後,光電流強度就沒有明顯提升了,是不是也是個線索。


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