Science：監測腸胃道健康狀況的可食性細菌電子系統

文獻標題

An ingestible bacterial-electronic system to monitor gastrointestinal health

基本資料

• 作者：Mark Mimee
• 年份：2018
• 期刊：Science

關鍵字

• edible electronics
• Whole-cell bacterial biosensors

提要

體內複雜環境和訊息回傳方式限制了腸胃道分子的即時監控。此論文設計的微生物電子裝置（ingestible micro-bio-eletronic device, IMBED）結合具生物偵測功能的基改細菌，以及能將訊號傳輸到外部的電子元件。當體內分子經半透膜進入IMBED，基改細菌會將之代謝產生螢光，再為感光裝置接收，最後轉變成訊號傳遞至外部接收裝置。

為了檢驗此概念，作者首先設計了監測heme（出血標記分子）的基因迴路（genetic circuit），再轉殖到 E. coli MG1655並浸潤於不同種類、濃度的溶液中，測試其偵測heme的效力。進而以不同方式提升靈敏度後才轉殖到後續實驗用的 E. coli Nissle 1917。

在小鼠的實驗中確認此生物感測器能在腸道發揮作用後，作者進一步在豬隻身上測試IMBED的原型，結果顯示此裝置不僅電力、耐用、安全堪用，也能在兩小時內成功測得預先灌食的微量血液。此外，能監測其他生物分子的菌叢也證明效果正面，表示往後可以IMBED為平台，搭載多元的生物感應器監測體內環境，這將有助於診斷與治療腸胃道疾病。

測試IMBED成效的實驗手續

筆記

微生物作為生物感測器

優點

• 微生物能感應外在變化。
• 微生物能在體內環境生存。
• 合成生物學技術足以改變微生物基因迴路(genetic circuits)，監測特定分子。
• 非侵入式檢查。

缺點

• 分析對象為微生物在排遺中的基因表現，得操作繁瑣的分子生物試驗。
• 由於無法即時得知監測結果，難以偵測半衰期短的分子。

微電子元件作為生物感測器

優點

• 可安裝無線通訊系統。
• 現今工程技術可以壓縮體積和能源需求。
• 除了特定化學物質，也可監測光學、溫度和酸鹼值(導電量)

缺點

• 腸胃道大小限制了感測器的體積，體積又限制能源和功能。

可食性微生物電子裝置（IMBED）

全名為ingestible micro-bio-eletronic device，由感測分子的生物系統和向外傳訊的電子系統組成，結合了微生物和電子元件的優點。

生物系統代謝目標分子後產生的螢光，被電子系統偵測並轉換為電子訊號傳輸到體外的接收裝置，例如手機或電腦等。

生物系統的基因迴路

作者以檢查腸胃出血為目標，設計了偵測heme的負調控基因迴路（genetic circuit）

•  heme：血基質，紅血球破裂後會溢出的物質，可充作出血的標記。在此基因迴路中是inducer。
• ChuA：可將heme運輸至細胞內的運輸蛋白。
• PL(HrtO) ：promoter 。
• HrtR：repressor。
• LuxCDABE：偵測到heme後需要表現的基因，例如螢光蛋白等。

當環境中有heme時，ChuA會將之運送到胞內，接著HrtR與之結合後不再抑制此基因組，於是LuxCDABE得以表現。

生物系統的 in vitro 測試

1. 評估基因迴路是否有效

　　

將組成不同的基因迴路轉殖到E. coli MG1655，浸潤在不同的溶液中，以溶液濃度和螢光值為兩軸作圖。結果符合預期：僅帶有LuxCDABE的菌叢因不受任何物質抑制，有高螢光表現量；另一方面帶有抑制子HrtR，可是缺乏ChuA通道蛋白的菌叢，因為胞內缺乏heme所以不受溶液濃度影響，維持相對低的螢光表現量。惟同時帶有三種基因者，其螢光表現量能反應出溶液的濃度，故確認此基因迴路有效。

2. 提升基因迴路的靈敏度

雖然有很多途徑可能會改變HrtR和PL(HrtO) 的親和力，進而提升基因迴路的靈敏度，但是當中最有效的就屬改變HrtR基因的核醣體結合位（ribosome binding sites, RBS）。有較高轉錄起始能力（translational initiation strength）的結合位，HrtR基因表現量就會愈大，於是HrtR與PL(HrtO) 親和力更佳，在溶液濃度低時螢光表現量較低。

當溶液濃度升高，HrtR與PL(HrtO)親和力佳者的親和力改變幅度比親和力差者高，螢光表現量改變幅度也較大，所以顯得更靈敏。(斜體部分是我的推測。)

同樣是以E. coli MG1655為實驗材料。

3. 生物系統採用的菌種

將基因迴路轉殖到IMBED平台用的E. coli Nissle 1917 ，浸潤在不同的溶液中，分別以時間、濃度對螢光表現量作圖，結果顯示基改後的菌種能對裂解的血液快速反應，和先前的菌種相比有過之無不及。

生物系統的 in vivo測試

in vivo 以小鼠為材料，餵食Indomethacin誘發上消化道出血，再餵食血液感測器（即前述的基改細菌E. coli Nissle 1917），測試感測器效果。

1. 血液感測器通過腸胃道後的殘留比率。

在Indomethacin實驗前，先測試血液感測器通過腸胃道後的殘留比率，結果顯示在六小時後所有小鼠的排遺中皆殘有血液感測器，二十四小時後檢測不到血液感測器，換句話說它們沒有在腸胃道拓殖。

2. Indomethacin實驗

實驗設了兩個陰性對照：餵食Indomethacin/PBS buffer、在餵食Indomethacin前/後餵食血液感測器，腸胃出血會以guaiac test確認（一種糞便潛血測試）。結果顯示血液感測器確實能在活體中檢測到出血狀況。

3. 血液感測器殘留比率

Indomethacin實驗的排遺也同樣分析感測器殘留比率。（可是我看不出含意。）

電子系統的穩定度測試

每個IMBED的電子系統當中都有四條channel，其中一條reference channel負責校正背景光源以及因溫度產生的電流（而非因螢光產生電流），其餘三條則獨立量測後再平均得出觀測值。作者分別以輸入光功率、溫度和模擬胃液測試電子系統在不同情況下的穩定度，結果表示電子系統合用。

1. 輸入光功率（ optical input power）

以各組IMBED內三條channel在不同功率下產出電流之平均值為x軸，各組的變異係數（coefficient of variation）為y軸。（由於我不懂意思所以只把圖放上來，原文中描述＂The electronic system was highly sensitive and captured photon flux as low as 5 ×

104 photons/s incident on the 0.29-mm2 area

of the detectors ＂應該是不錯的意思。）

2. 溫度變化

　　

殘差分析（之前寫錯，待補）

3. 模擬胃液（ Simulated Gastric Fluid ）
電子系統至少能在模擬胃液中穩定運作三十六小時，足以應付消化過程中生物分子的監測。

IMBED的in vitro測試

組合生物系統和電子系統為IMBED的原型，當中每個reference channel都裝配了Wild-type Nissle作對照。將IMBED浸潤於濃度不一的血液中，評估其感應時間。其中IMBED的感應比E. coli Nissle 1917延遲了一段時間，作者推論是分子從IMBED外擴散到內部的時間所致。

(y軸不同，這兩張圖只是參考用。)

IMBED的in situ測試

IMBED最後在三頭豬身上反覆測試。置放IMBED前，先餵食中和溶液避免裝置在酸性環境失效。

1. 測試IMBED在豬隻體內的反應時間

血液最早可以在餵食IMBED後52分鐘被偵測。其中僅餵食Buffer的控制組在一段時間後光電流微量提升的現象，作者歸因於飲食中少量的heme、安裝內視鏡時刮擦黏膜引發出血、或是從胃壁滲出的血液、……等腸胃道中的heme。另外光電流提升幅度在溫度變化造成的誤差範圍內（見電子系統的穩定度測試），或許是餵食低溫中和溶液影響了腸胃環境所致。

2. 評估IMBED最佳的反應時間

這是一張ROC曲線圖（receiver operating characteristic curve），用以分析偵測系統的優劣。以此實驗為例，判斷是否出血的依據是IMBED在腸胃道中測得的光電流量。如果我們訂定測得光電流量α代表診斷出腸胃道出血，那麼每次測得的結果就有四種：真陽性（診斷有，實際有）、假陽性（診斷有，實際無）、真陰性（診斷無，實際無）、假陰性（診斷無，實際有）。

曲線圖中y軸代表真陽性率（在所有實際為陽性的樣本中，被正確地判斷為陽性之比率。），x軸代表偽陽性率（在所有實際為陰性的樣本中，被錯誤地判斷為陽性之比率。），同一條曲線上的每個點都代表採用一種診斷標準時，樣本的真陽性率和偽陽性率，例如：圖中的紅點就代表「60分鐘後，光電流量高於α者代表腸胃道出血」的真陽性率約為0.8，偽陽性率約為0.5。

圖左上角的點(0,1)代表真陽性率為1，偽陽性率為0，代表這個診斷標準能完美的預測出血；反之，圖右下角的點(1,0)則是最差的預測。至於在圖中藍色線段上的點，它們的真陽性率和偽陽性率相同，代表這些診斷標準無異於隨機預測。

由於可以用不同診斷標準來判定是否出血，所以同是60分鐘後測得的光電流量的樣本就可以有好幾種比率，將之在圖上標記並連結起來就獲得ROC曲線。而ROC曲線底下面積（Area under the Curve of ROC , AUC ROC）的意涵是「若隨機抽取一個陽性樣本和一個陰性樣本，偵測器正確判斷陽性樣本的值高於陰性樣本之機率」，也就是說AUC愈大，則此偵測系統的正確率愈高。

此實驗中，經過120鐘後獲得的數據有最大的AUC值，因此是IMBED判斷最正確的反應時間。

3. 檢驗IMBED的信號是否源於帶有完整基因迴路的生物感測器。

IMBED裝載帶有不同基因的E. coli Nissle 1917操作實驗。如圖所示，唯有帶完整感測基因的菌叢才能偵測螢光，表示此螢光是出血標記heme活化這些菌叢造成的，而不是豬隻腸胃道其他物質造成。（小鼠的實驗不做此測試是因為，IMBED原型最終要在豬體內測試，兩者腸胃道環境不同。）

展望和方向

• 縮小IMBED，以便人類使用。
• 搭載偵測不同分子的生物系統。
• 在同一裝置內安裝更多channel，重複測試提降低誤差。
• 改善菌叢保存方式。
• 從一次性測試轉向留在體內長期監測。

疑問

• 為什麼測試基因迴路和裝在IMBED平台上要用不同菌種？
• 生物系統的 in vivo測試前，先計算血液感測器通過腸道殘留的比率之用意為何？
• 裝置不能反映出血位置，只能用X光片或信號出現的時間反推。
• 除非裝置能在測量途中歸零，不然無法判斷反覆出血，上消化道跟下消化道同時出血的話，裝置沒辦法區分。
• 在IMBED的in vitro測試中，作者認為擴散速度影響了其反應時間。從IMBED的時間-光電流量曲線圖和E. coli Nissle 1917的時間-螢光值曲線圖的圖形，是否可以佐證這個看法？（雖然圖形跟座標和單位長設置有關）後者的圖形是典型的S狀，而前者卻接近線性，似乎為heme的擴散速率限制。另外，當濃度提升到250ppm後，光電流強度就沒有明顯提升了，是不是也是個線索。