Nature：TEDDY 計畫之嬰幼童早期腸道菌相的逐月發育

Temporal development of the gut microbiome in early childhood from the TEDDY study

大樣本、長時間、多中心研究描繪了嬰幼兒四歲前腸道菌相的發育軌跡和與之相關的外在因素。

一、研究總結

1. 人體微生物研究有許多不確定性

近十五年來因為定序技術成本下降以及分析方法進展，人體微生物研究方興未艾，尤其是因為與健康的關聯，腸道微生物領域成為各方的焦點。除了在人群間的對照研究發現不同疾病與腸道菌的關聯性，利用小鼠等模式生物，研究人員也進一步探討了菌群與疾病的因果關係。

然而人體研究不若模式生物研究，研究人員無法控制參與者的遺傳背景與後天習慣，讓原本已經相當複雜的微生物生態系統增添許多無法控制的干擾。為了在充滿噪聲的系統中辨識組間差異並判斷外在因素與菌群變化的關係，需要充足的樣本確保統計的顯著性，但多數研究無法取得足夠的樣本來排除這些干擾。

2. 先前研究的族群規模和縱向樣本數有限

雖然人體微生物計畫 (HMP, Human Microbiome Project) 等國家級的計劃收集了大批成年人的排遺樣本，勾勒了正常人的腸道菌群組成和變化。然而在此文發表前，還沒有相當規模的研究投注在嬰幼兒的腸道菌群發育。既有研究或許有充份的樣本，但採樣的頻率不足以描繪菌群的動態變化；少數長期追蹤的研究案例僅包含少量的實驗對象，限制了結果的推廣範圍。

3. 結論

Stewart et al. 逐月採集了 903 位來自美國、德國、瑞典與芬蘭的嬰兒自出生到四歲前的排遺樣本，利用標識基因定序和全基因體定序取得樣本的物種和功能組成資訊，透過多樣性分析、差異表現分析和迴歸分析探究生命早期人體微生物的發育狀況，並且辨識跟腸道菌有關的臨床因素，他們得出的結論如下：

• 嬰兒腸道菌群的發育不是隨機無序的過程，而是經過發育期、過渡期和穩定期等階段逐漸成熟。

• 儘管分娩方式、生活環境、手足或寵物等外在因素皆與腸道菌群的組成有關，母乳仍是周歲前關聯最顯著的要素

• 嬰兒腸道菌的組成與自體免疫病程有些許關聯

4. 研究的重要性

Stewart 的研究以較大的樣本數和不同國籍的嬰兒描繪了腸道菌群的發育軌跡，並探討了不同臨床因素與之的關聯，可為往後的研究參考。此研究亦與近期的剖腹產研究互為補充，完整勾勒了出生到幼年腸道菌群的發育里程

5. 本文將聚焦哺乳的研究結果

儘管此研究涵蓋了不同的內容，但因為我對於飲食相關的菌相差異感興趣，所以本文將聚焦與哺乳相關的結果。在說明論文的研究設計和結果討論之餘，我也會補充額外的背景資訊和個人解讀。

二、為什麼要關注嬰兒腸道菌的發育及其與哺乳行為的關係？

1. 腸道菌發育攸關個體的健康狀況

如前所述，腸道菌因其與健康的關聯而在近年備受矚目。嬰兒腸道菌的建立期間，個體的組織器官亦逐漸成熟，然而兩者非平行無涉，宿主與共棲菌的交互作用攸關消化系統、免疫系統乃至神經系統的健全。是以，嬰兒腸道菌群的發育不僅關乎幼年時期的健康狀態，也可能影響宿主的生理平衡，從而增加往後罹患哮喘、糖尿病或發炎性腸病等疾病的風險。

2. 除了流行病學、醫學和生理學，腸道菌群研究也是生態學議題

在流行病學、病理學與醫學領域外，嬰兒腸道菌群亦是生態學的研究標的。原則上，嬰兒腸道菌的建立可視作初級演替的案例，在出生後（甚至在子宮內）接觸到環境微生物，接著這些微生物在腸道內逐步發展與成熟。人體這個與微生物高度互動的環境提供測試理論和發掘新關係的機會，得以觀察在不同時機和不同因素下，腸道菌群的反應與結果。

3. 哺乳行為能作為關聯研究的起點

儘管目前已辨識出遺傳、行為與環境皆與嬰兒腸道菌群的組成有關，但哺乳行為有以下幾項利於關聯研究的特性。

• 影響明顯：相較於一些基因與腸道菌的關聯，在小鼠與人體中，飲食都是影響腸道菌群的主要因素，得以在不同的臨床分組中觀察到組成差異。

• 時段明確：哺乳的始末相較於器官組織發育明確。消化系統和免疫系統的成熟固然影響深遠，但既不容易為發育劃分出明確的始末，也鮮有發育狀態的臨床紀錄。

• 普遍：患病與服藥雖然有較明確的干擾時段，也對腸道菌有相當影響，然而相較於普遍發生的哺乳行為，抗生素干擾的資料較為稀少而不普及。

• 可解釋：除了前述因素，手足、寵物和居處等也與腸道菌群的群集組成有關，但是相較於母乳直接接觸腸道環境，這些外在因素和腸道菌群的關聯性較不易解釋。

因此，基於關聯、普及、明確和解釋性，許多嬰兒腸道菌研究計畫中皆有包含了哺乳的分析。

三、 過往的經歷和當前的狀態，何者是嬰兒哺乳行為相關之菌群差異的關鍵？

1. 既有研究發現哺乳行為攸關嬰兒腸道菌的組成

既有研究藉由比較哺餵母乳與餵食配方奶的嬰兒或是哺乳時間不一的嬰兒的腸道菌相，發現不同飲食型態的嬰兒腸道菌相有許多差異。例如，相較於哺乳時間較短或餵食配方奶嬰兒，哺餵母乳者的腸道菌多樣性較低，而菌群中能代謝母乳寡糖的雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium) 和見於母乳的乳酸桿菌屬 (lactobacillus) 之物種比例較高。通過樣本的群集組成預測採樣時間，從而得出菌群年齡 (Microbiota age) 後也發現，僅餵母乳者的腸道菌年齡也往往低於非純餵母乳者。儘管各項研究的結果可能因樣本準備方法、族群差異、地域限制等因素影響而有些許差異，但這些結果反映了哺乳行為與嬰兒腸道菌群集組成的關聯性。

2. 既有研究的臨床分組反映了哺乳經歷和哺乳狀態兩種潛在影響因素

除了飲食內容差異，既有研究的臨床分組方式也揭示了兩種與哺乳時機相關的因素。Hill et al., (2017)將研究對象依哺乳日程長短分組，而 Pannaraj et al., (2017)則比較每日的母乳攝取量不同的嬰兒。這類依照哺乳時間長短、母乳攝取量或哺乳時間比例劃分臨床組別的研究關注嬰兒哺乳的經歷。

另一類型則以 Bäckhed et al., (2015) 代表，Bäckhed et al. 比對產後周年時仍餵母乳者與停餵母乳者的腸道菌群群集組成。結果顯示常見於成人腸道的菌屬富集於停餵母乳者，而代表生命早期的腸道菌屬則富集於仍餵母乳者，代表嬰兒腸道菌群的群集組成不只與哺乳的經歷有關，也和採樣時的哺乳狀態有關（即與採樣時是否哺乳有關）。

3. 過往的經歷和當前的狀態，何者是哺乳相關菌群差異的關鍵？

儘管從哺乳相關的菌群差異可以歸納出狀態和經歷兩種跟時間有關的要素，但它們的涵義並不同。在時機上，狀態反映當前的影響，經歷反映過去的影響；在作用上，狀態強調即時的效果，經歷強調累積的效果；在時效上，狀態反映短暫的作用，經歷反映延續的作用；在機制上，狀態可能意味著母乳直接影響菌群，經歷則可能是母乳藉改變環境間接影響菌群。

雖然 Bäckhed et al. 等人支持母乳哺餵的狀態重要性，主張嬰兒菌群在停餵母乳後歷經大幅轉變，逐漸形成近似成年人的腸道菌群。但鑒於前述幾個哺乳經歷的研究結果，如果哺乳經歷的影響具有延伸效果，離乳期間的菌群變化可能僅為哺乳佔嬰兒生命史的比例下降所致，而與停餵母乳無關。

是以哺乳狀態與哺乳經歷的含意差異不僅攸關母乳影響菌群的機制，也可能解釋離乳對於腸道菌群的影響。然而目前同時探討哺乳狀態和哺乳經歷的研究有限，是以此研究試圖從哺乳相關的菌群差異中區分兩者的影響，釐清過往的經歷和當前的狀態，何者是哺乳相關菌群差異的關鍵。

四、要怎麼決定哪種假說比較合理？

1. 以對照實驗和臨床指標揭示行為與菌相的關係

Stewart et al. 依飲食型態劃分嬰兒為數組，繼而比較同一時間各組的腸道菌相差異，藉此判斷哺乳經歷與哺乳狀態各自與腸道菌的關聯。

• No breast milk ever: 不曾哺乳

• After breast milk: 已離乳（曾哺乳，但採樣時已停餵母乳）

• Some breast milk: 未離乳（即有餵食母乳以外的食品）

• Exclusive breast milk: 僅哺乳

其中 No breast milk ever 和 After breast milk 表示採樣時沒有哺乳，Some breast milk 和 Exclusive breast milk 表示採樣時有哺乳。從 No 、 After、Some 到 Exclusive 則反映了哺乳的比例，代表與經歷有關的臨床分組。

2. 如果哺乳經歷 / 哺乳狀態攸關嬰兒腸道菌相…

若哺乳經歷攸關嬰兒腸道菌的組成，可預期四個組別可能呈現某種暴露與反應關係，例如　No breast milk ever 和 Exclusive breast milk 者的腸道菌群 α 多樣性差距最大，而 After breast milk 和 Some breast milk 者的 α 多樣性則居間。

但如果哺乳狀態才是腸道菌群組成差異的關鍵，可以預測採樣時仍哺乳的組別（Some breast milk & Exclusive breast milk）和沒有哺乳的組別（No breast milk ever & After breast milk）有較顯著的差異。

綜上所述，Stewart et al., (2018) 透過不同的臨床分組和適當的生態指標，比較分析結果與預測的關係，藉此判斷哺乳相關菌群差異的關鍵是過往的經歷還是當前的狀態。

五、怎麼解決採樣年齡不一的問題？

1. 採樣年齡不一致引發的問題

由於嬰幼童的腸道菌群在三歲前仍持續發育，所以年齡是此研究潛在的干擾來源。為了避免結果受影響，應確保對照實驗中各組樣本的採樣時間一致。然而此研究中各對象的採樣年齡不一，是以採自相同年齡的樣本有限，導致可使用的樣本數下降。雖然可以藉由降低時間的解析度，例如併採樣時間相近的樣本為一組，但此舉亦會擴大組內的差異，引入其他形式的干擾。

（年齡是可能的干擾因素，圖中五到六月間菌相大幅轉變，所以該區間內的樣本組間差異較其他時間大）

2. 利用 DMM 分群量化腸道菌發育的階段

Stewart et al. 以 Dirichlet multinomial mixtures (DMM) 模型，搭配 lowest Laplace approximation 分全數樣本為十個類群，接著觀察不同時間點的樣本各屬於何種類群，即可度量嬰兒腸道菌相隨時間的變化趨勢。

3. 衡量樣本數與組內差異劃分時間區間

在量化腸道菌的發育階段後，便能以此為依據尋找樣本數充足而且菌相變化較緩的時間區間。橫軸是 Stewart et al. 劃分的時間區段，而縱軸和圓圈的顏色則是樣本所屬的類群，圓圈的大小表示樣本的數量。此圖也佐證了嬰兒腸道菌群隨時間發育的報導，因為各時間點樣本所屬的類群逐漸改變，並在一定時間後穩定下來。

(adapted from figure 1c)

基於同一時間點的樣本之間的相似性，Stewart et al. 僅取同一研究對象在該時間區間內的第一個樣本為代表接續往後的分析。

五、嬰兒腸道菌的群集組成是否因哺乳行為而異？

1. 以 β 多樣性指標搭配排序分析觀察樣本間的關係

在解決了採樣時間的問題後，接著要判斷不同飲食行為的嬰兒腸道菌相是否有差異。此處採用是排序分析。排序分析依照樣本群集組成的相異性，將樣本排列在二維平面或三維空間等人類可以理解的空間中，方便我們了解不同族別樣本的關係。此研究當中，Stewart et al. 以 Bray-Curtis dissimilarity 度量樣本差異，搭配 NMDS (Non-metric Multidimensional Scaling ) 執行排序分析。由於 NMDS 僅度量樣本間距的大小關係，而不關注實際距離，因此可用於非公制單位的 Bray-Curtis dissimilarity 以及資料關係非線性的生態學資料。

（排序分析可分為使用原始 OTU 表的 PCA 等方式，或是先計算樣本間距離的 PCoA 或 NMDS 等方式。）

2. 不曾哺乳與僅哺乳的嬰兒腸道菌群有別

此圖為三至六月各飲食分組的 NMDS 分析結果。由於樣本的數量過多，所以使用組中心替代，圖上的十字符號即是組中心所在座標的九成五信賴區間，十字交叉處的原點大小表示嬰兒的數量，符號的色系代表所屬的組別，符號間的距離反映了樣本組中心在高維空間的關係，距離越遠代表物種組成差越多。當中，Exclusive breast milk 和 No breast milk ever 的樣本組中心位於不同位置，表示腸道菌群的物種組成與哺乳有關。

(adapted from figure 3a)

3. 嬰兒腸道菌群的群集組成因採樣時哺乳與否而異

接著觀察 Some breast milk 的樣本組中心，依照前述的預測，若經歷是母乳相關之菌群差異的關鍵， Some breast milk 的樣本組中心應該會介於 Exclusive breast milk 和 No breast milk ever 之間。然而實際上 Some breast milk 的樣本組中心接近 Exclusive breast milk ，表示採樣時仍哺乳的樣本物種組成相似，支持哺乳狀態的重要性。

最後關注 After breast milk，若經歷是母乳相關之菌群差異的關鍵，After breast milk 的樣本組中心也應該會介於 Exclusive breast milk 和 No breast milk ever 之間。但實際上 After breast milk 的樣本組中心接近 No breast milk ever，表示無論過往的哺乳經歷如何，採樣時沒有哺乳的嬰兒腸道菌相較接近。兩項結果共同支持嬰兒腸道菌群的差異取決於哺乳狀態而非哺乳經歷。

六、採樣時仍哺乳的嬰兒腸道菌相與離乳者有何差異？

1. 以 α 多樣性指標了解樣本的特性

儘管已經得知嬰兒腸道菌群的組成因採樣時哺乳與否而異，仍需要描述樣本內菌群特性的指標，以了解嬰兒哺乳狀態的差異體現在那些群集特徵。 α 多樣性是指樣本內的菌群多樣性，依照用途可分為物種數（樣本內有多少物種？）、均勻度（樣本內各物種的族群規模是否平均？）和多樣性（如何比較物種數和均勻度不一的樣本多樣性？）三個層面，其中微生物分析常用的 Shannon index 即是在均勻度不一的情況下，衡量樣本物種數的指標，可作為描述菌群的可行方式。

2. 採樣時仍哺乳的嬰兒腸道菌相多樣性較未哺乳者低

(adapted from figure 3c)

此為不同飲食分組的 Shannon diversity 逐月變化圖。橫軸是採樣時間，縱軸是 Shannon diversity 的數值，數值越高代表樣本內的物種數越多，各族群的規模也較均勻。圖上的平滑曲線則是利用區域性回歸法 (LOESS) 擬合出的曲線，此方法較傳統的線性迴歸更能反映腸道菌群的非線性變化。

如同排序分析的結果，嬰兒腸道菌群的多樣性因採樣時哺乳與否而異，未哺乳者的多樣性往往高於哺乳者， Stewart et al., 推論此現象可能源於哺乳者腸道內的優勢物種影響了均勻度，以致整體的多樣性下降。然而不同飲食狀況的嬰兒腸道菌群差異會隨時間消弭，最後收斂於穩定值。

3. 其他的指標也有類似的現象嗎？

除了多樣性的差異，綜觀不同哺乳狀態的嬰兒腸道菌群 α 多樣性的發育趨勢，採樣時仍哺乳的嬰兒似乎較晚才達到全體多樣性的穩定值，意味著其菌群發育的較未哺乳者遲，然而其它的生態學指標是否有相似的結果仍待確認。

七、持續哺乳的嬰兒，腸道菌相發育是否較遲？

1. 腸道菌相年齡推算腸道菌群的發育階段

（菌相年齡的概念假設各發育階段皆有能反映該階段的菌種）

為了評估採樣時仍哺乳的嬰兒腸道菌相是否可能有前述的遲緩現象，Stewart et al. 比較哺乳者與未哺乳者的菌群年齡。菌群年齡是從樣本預測的採樣年齡，可用於評估腸道菌發育階段，其有以下幾個假設：

• 菌群漸進發育

• 發育的不同階段有不同的特性

• 物種組成變化可以反映不同階段的不同特性

• 存在只出現在特定發育階段的特徵物種 

基於這些假設，即可計算這些指標物種的數量分布，估算樣本的採樣時間。此處的作法是使用隨機森林回歸，以自然產且哺乳的嬰兒為訓練集建立年齡預測器。如果未哺乳者的預測年齡大於哺乳者，代表未哺乳者的腸道中含有較多象徵發育晚期的細菌，意味著其菌群年齡較高。

2. 採樣時仍哺乳的嬰兒腸道菌相年齡較未哺乳者低

(adapted from figure 3d)

此圖呈現各飲食分組的菌群年齡（樣本預測採樣時間）變化，橫軸是採樣時間，縱軸是菌群年齡。結果顯示在產後二十個月前採樣時沒有哺乳者的腸道菌群年齡較哺乳者高，符合前一節的預期，也支持 Bäckhed et al., (2015) 等人關於離乳後腸道菌群逐漸成熟的主張。

八、為什麼哺乳的狀態與嬰兒腸道菌相有關？

1. 哺乳相關的菌相差異可能與選擇壓力有關

先前的結果指出了嬰兒腸道菌相因採樣時的哺乳狀況而異，而這些差異體現在菌群的 α 多樣性和年齡上。然而為何菌群會有這些差異仍不明朗，其中一種解釋是母乳當中的母乳寡糖或免疫蛋白等物質營造了選擇壓力，能代謝母乳營養物質的細菌在此種環境下有較高的適存度，因此族群規模也較大。依照這個假說可以預測哺乳者的腸道菌群可能帶有些能代謝母乳營養成分的基因，而這項預測可以利用總全基因體學檢驗。

2. 總全基因體學搭配KEGG pathway 差異分析揭示菌群的代謝潛力

相較基於 16S rRNA 基因的標識基因分析，全總基因體分析定序了樣本中所有的基因，所以可以獲悉菌群帶有哪些基因，透過功能資料庫註解後即可了解這些基因參與了哪些生理必須的代謝途徑，進而得知菌群的代謝功能潛力。

（KEGG 資料庫的架構）

然而限於目前的知識，我們實際上是無法盡知定序資料中所有序列的功能為何。因此所謂的基因功能途徑註解，其實是利用該基因與已知基因的相似性推測同源性(ortholog)，再基於同源基因的功能彼此相似的假設，預測該基因的轉譯產物 (KEGG orthology)，最後重建這些基因可能參與的功能模組和反應途徑 (KEGG module & KEGG pathway)。

3. 採樣時仍補乳的嬰兒富集代謝母乳相關的途徑

此圖展示不同時間區間以及不同哺乳狀態的嬰兒，腸道菌不同代謝途徑的差異表現狀況。下方欄是 KEGG modules，暖色系表示數量豐富，冷色系表示數量稀缺；上方欄則是各 modules 所屬的 KEGG pathway，紫色是碳水化合物與脂質代謝途徑，綠色則是能量代謝途徑，灰色表示其它種途徑。此處顯示的是經 MaAsLin 分析在不同飲食狀態有顯著數量差異的功能途徑。

(adapted from figure 3e)

由圖可知，哺乳者與未哺乳者數量豐富的  KEGG modules 明顯不同，再檢視這些  KEGG modules 所屬的  KEGG pathway 得知，哺乳者富集脂肪和碳水代謝途徑，而未哺乳者則富集其他能量代謝途徑，符合哺乳相關差異可能體現在與菌群代謝母乳成分的預期。

九、結論

藉由排序分析、多樣性分析、菌相年齡分析以及代謝途徑分析， Stewart et al. 發現嬰兒腸道菌的組成因採樣時的哺乳狀況而異，哺乳者的 α 多樣性和菌群較未哺乳者低，此現象可能與母乳的成份有關。

這些結果顯示當前的狀態是哺乳相關菌群差異的關鍵，支持嬰兒腸道菌群在停餵母乳後會歷經大幅轉變的主張。

十、參考資料

Bäckhed, F., Roswall, J., Peng, Y., Feng, Q., Jia, H., Kovatcheva-Datchary, P., Li, Y., Xia, Y., Xie, H., Zhong, H., et al. (2015). Dynamics and Stabilization of the Human Gut Microbiome during the First Year of Life. Cell Host Microbe 17, 690–703.

Hill, C.J., Lynch, D.B., Murphy, K., Ulaszewska, M., Jeffery, I.B., O’Shea, C.A., Watkins, C., Dempsey, E., Mattivi, F., Tuohy, K., et al. (2017). Evolution of gut microbiota composition from birth to 24 weeks in the INFANTMET Cohort. Microbiome 5, 4.

Pannaraj, P.S., Li, F., Cerini, C., Bender, J.M., Yang, S., Rollie, A., Adisetiyo, H., Zabih, S., Lincez, P.J., Bittinger, K., et al. (2017). Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. 171, 647–654.

Stewart, C.J., Ajami, N.J., O’Brien, J.L., Hutchinson, D.S., Smith, D.P., Wong, M.C., Ross, M.C., Lloyd, R.E., Doddapaneni, H., Metcalf, G.A., et al. (2018). Temporal development of the gut microbiome in early childhood from the TEDDY study. Nature 562, 583.