排遺與腸道樣本的細菌群落差異

哺乳動物的排遺樣本代表游離於腸道腔室的細菌（luminal microbes），黏膜樣本則反映棲居於腸道黏膜細菌（mucosal microbes）。許多研究指出，排遺樣本與黏膜樣本的細菌群落組成有別。

例如，在排序分析當中，樣本點往往依採樣部位分群。這意味著排遺樣本未必能反映腸道黏膜的細菌群落組成，而這些細菌的組成與宿主許多生理與疾病相關。

Suzuki & Nachman. (2016). Spatial heterogeneity of gut microbial composition along the gastrointestinal tract in natural populations of house mice. PloS one, 11(9), e0163720.

Suzuki & Nachman 比較雌雄各半，共六隻家鼠從口腔到排遺等消化道十個部位的細菌群落。他們發現，上消化道與下消化道的物種和功能基因組成不一。此發現可為基於分類和功能資訊的 PCoA 分析佐證：來自上和下呼吸道的樣本可以明顯區分為兩群。

相較於消化道部位，飲食或個體差異對於整個消化道的變異沒有什麼影響。值得留意的是，排遺與下消化道的細菌群落相似，所以作者推論排遺樣本可以反映下消化道的細菌群落組成。

由於此研究採用的分類階層僅至於科，所以排遺與下消化道的細菌群落在屬與種的層次是否相似仍須釐清。此外，我留意到論文方法裡沒提到是否有清理黏膜上的殘渣。如果沒有清腸，仍會保留部分游離菌叢和黏膜菌叢，那麼排遺與下消化道樣本會很相似應該是可以預期的。

Durbán et al. (2011). Assessing gut microbial diversity from feces and rectal mucosa. Microbial ecology, 61(1), 123-133.

Durbán et al. 提及排遺包含了因無法拓殖而游離在腸道的細菌，以及脫離黏膜的共棲菌。因此，需要比較排遺與黏膜樣本的差異，釐清排遺樣本的代表性。

此研究以人體為材料，採取了和以往研究不同的策略，即分別採集黏膜樣本和糞便樣本，並且(1) 盡可能縮短樣本採集的時間間隔，(2) 事前不清腸，降低技術誤差。

結果指出，排遺樣本的細菌多樣性低於腸道樣本。其次，排序分析亦顯示細菌群落組成因採樣位置而異，意味著排遺樣本無法忠實反映黏膜樣本的微生物相。

儘管如此，通過排遺樣本推斷腸道細菌群落暫無替代方案。因此，這類研究的用意，並非否定排遺樣本的價值，而是藉此減少這些差異造成的誤判。

Carstens et al. (2018). Differential clustering of fecal and mucosa‐associated microbiota in ‘healthy’individuals. Journal of Digestive Diseases, 19(12), 745-752.

Carstens et al. 觀察健康人的排遺與黏膜細菌群落差異：

(1) 以 NMDS 排序樣本，發現黏膜樣本的組內差異較排遺樣本小 

(2) 黏膜樣本的多樣性略大於排遺樣本

(3) 個體在門分類階層的細菌族群規模在兩類樣本中不同

我猜，黏膜樣本的變異小於排遺樣本是否跟飲食汙染有關？因為排遺樣本的細菌群落變化不只跟黏膜細菌的變遷有關，也可能隨飲食內容影響。若是如此，是否會造成在新生兒上觀察到的階段性變化並非共棲菌組成改變，而是因為源於飲食的細菌不再補充？

Ingala et al. (2018). Comparing microbiome sampling methods in a wild mammal: fecal and intestinal samples record different signals of host ecology, evolution. Frontiers in Microbiology, 9, 803.

此研究觀察不同種蝙蝠的糞便微生物相與腸道黏膜微生物相差異，發現野生蝙蝠的排遺與黏膜細菌群落有別，且分別反映了宿主的飲食與親緣關係。

此研究指引了黏膜樣本與排遺樣本差異的可能原因。不過，我曾思考，為何這類研究都會同時比較 weighted UniFrac 呢？假設黏膜樣本與排遺樣本的差異源於飲食，那是不是主要區別在於物種而不是相對數量？況且兩種地方的採樣方式評估的數量誤差應該都很大，是不是單用 unweighted UniFrac 比較適合？

Summary

相較於游離在腸腔的細菌，棲息於黏膜的細菌因為在空間和時間上與宿主更為密切，被視為與宿主的生理乃至演化有關。目前有許多研究在探討腸道細菌對宿主消化、免疫、發育與神經等系統健全的影響。

基於共棲細菌與宿主的關聯，亦有研究著重於兩者的譜系共生現象 (phylosymbiosis)，即共棲微生物組成差異能充分反映宿主間的親緣關係。此現象在演化方面，暗示了微生物與宿主歷史上互動的線索；在生態方面，則蘊藏微生物群落構建與演替機制的蛛絲馬跡。

雖然本文摘要的幾則文獻一致顯示排遺與腸道樣本有別，但因為腸道樣本不易取得，透過排遺樣本推論腸道細菌群落仍是主流。在小鼠研究中，往往要靠解剖來採集腸道樣本，但這麼一來，便無法取得個體的時間序列資料。

在人體當中，採樣的限制又更多了。常見的方法是研究割盲腸或切胃等手術後移除的組織，或是利用內視鏡採樣。儘管內視鏡採樣似乎能獲得各部位的時間序列資料，不過施術前要清腸，能影響腸道的微環境。

其次，內視鏡伸進腸道的過程絕對不好受，所以不太可能達到排遺樣本的採樣頻率。至於位於小腸的細菌群落，因為位置關係，目前各種方法都不容易採集。

因此，或許要把排遺與腸道樣本當作互補的資訊：前者採樣容易，後者採樣困難；前者採樣頻率高，後者採樣頻率低；前者資訊較攏統，後者資訊較具體；前者可用於健康檢驗與時間序列；後者可用於觀察與驗證結果。

透過比較排遺與腸道樣本差異，可釐清排遺樣本的代表性，了解研究結論的推廣性。除此之外，兩種樣本的差異，或許也反映了長期棲居與短暫停留的細菌，例如從母乳、腸道和排遺樣本的組成，也許可以推論細菌由母親直系傳遞給子代的途徑。